白芷質量控制按對照提取物定量研究

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摘要:目的評價用對照提取物定性和一測多評定量相結合的方法對白芷藥材進行質量控制。方法用高效液相色譜法，色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm)，流動相:乙腈－水梯度洗脫，流速:0.5mL•min－1，柱溫:30℃，檢測波長:310nm，進樣量:5μL。考察該方法的專屬性、標準曲線和定量下限、精密度與回收率、穩定性以及重現性。結果高效液相色譜法對白芷中的5種主要香豆素類成分，佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素進行了快速分離，線性關系良好(r≥0.9994)，回收率較高，均在96.4%～100.0%內。對照提取物能快速對白芷中的5種主要成分進行定性。單標定量方法測得成分含量與標準曲線法定量的結果一致。結論對照提取物定性和單標定量相結合的質量控制方法是簡單、可行的，能有效地對白芷藥材進行質量控制。

關鍵詞:白芷;質量控制;對照提取物;單標定量

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其主要活性成分為香豆素類化合物［1］。白芷作為中國傳統中藥，在河北省均有廣泛種植與分布，為河北省道地中藥材。然而由于不同的加工工藝以及不同的來源，市售的白芷質量存在一定的差異，為了保證用藥的安全有效，本研究將對照提取物鑒定和一測多評定量方法有機結合，建立中藥質控的方法，并將其應用于河北道地藥材白芷的質量控制研究，為中藥對照品缺乏下的中藥質量控制提供現實可行的方案。

材料和方法

1儀器與試藥

佛手柑內酯對照品，規格:每瓶20mg，批號:07111221，上海同田生物技術有限公司提供;歐前胡素、異歐前胡素、cinidilin和氧化前胡素，河北醫科大學藥學院自制，經HPLC－DAD分析純度不少于98%;白芷樣品1～6(自然晾干的切片)，采自河北安國;白芷樣品7～10(硫熏樣品)，購自河北石家莊當地藥店。標準白芷香豆素提取物由白芷總提取物經大孔樹脂分離和硅膠柱分離所得。包含了主要的5種香豆素成分:佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素，其色譜峰面積比例為0.2∶1.9∶1.0∶0.7∶0.8，與其在原藥材中的比例相似。1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司產品。

2色譜條件

色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm);流速:0.5mL•min－1;柱溫:30℃;檢測波長:310nm;流動相:乙腈－水梯度洗脫;進樣量:5μL。梯度洗脫程序為0～5min，45%～45%乙腈;5～15min，45%～80%乙腈。

3溶液的制備

對照品溶液制備分別稱取佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素對照品適量，用75%甲醇溶解、稀釋配制成質量濃度為1.0mg•mL－1對照品溶液。供試品溶液制備白芷藥材粉碎，過3號篩，稱取0.5g，置于50mL量瓶中，加入75%甲醇20mL，搖勻，稱定質量，超聲提取30min，取出，放冷，用75%甲醇補足質量，搖勻，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

4方法學考察

專屬性分別吸取對照品溶液和供試品溶液5μL，用上述色譜條件進行分析，考察待測組分與樣品中其他物質的分離情況。標準曲線與定量下限吸取對照品儲備液適量，稀釋成系列濃度，進樣并測定峰面積，以對照品溶液的濃度為縱坐標，相應峰面積為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。各分析化合物根據各自標準曲線進行定量(Method1)。將合適量的對照提取物溶解于75%甲醇中，配制成系列濃度的溶液，按上述方法對其中的主要成分歐前胡素進行線性回歸，用得到的標準曲線對5種香豆素類成分進行定量計算(Method2)。將混合對照品溶液逐步稀釋并進行測定，以信噪比S/N≥3時確定為檢測限，以信噪比S/N≥10時確定為定量限。精密度與回收率配制低、中、高3種不同的濃度，日內精密度是在同一天內對同一份樣品連續測定6次，日間精密度則是在連續3d內對同一份樣品進行測定，通過計算相對標準偏差來實現。取含量已知的白芷樣品0.25g，分別加入一定濃度的對照品溶液，按“供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，重復進樣，測定樣品溶液中有效成分的含量并計算平均回收率。穩定性取白芷藥材粉碎，按“供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24h取供試品溶液進樣測定峰面積。同時考察對照提取物溶液放置24h的穩定性。

結果

1方法學評價

專屬性在上述色譜條件下，待測成分各色譜峰與其他成分分離良好，其他成分不干擾待測成分的測定。典型色譜圖見圖1。標準曲線與定量下限5種成分的線性關系方程和線性范圍見表1，相關系數r≥0.9994，表明在線性范圍內，線性關系良好。精密度與回收率5個分析物的日內、日間變異分別小于1.3%和2.3%，回收率均大于96.4%，重復性良好(RSD≤1.3%)。結果見表2。穩定性樣品及對照提取物在室溫下放置24h是穩定的。結果見表2。

2方法學應用

按“供試品溶液制備”方法制備10個批次白芷供品溶液，按色譜條件進樣分析，測定5個成分的峰面積值。通過標準曲線法和單標定量法對白芷樣品中的5種測定成分含量進行了計算，結果見表3。為了評價單標定量的可行性(以歐前胡素為內參，對其余4種成分進行定量估算)，用不同百分數(PD)和向量余弦相似度［Cos()］對兩種方法得計算結果進行了評估。PD%=100×|X－Y|X+Y2，Cos()=∑ni=1XiYi∑ni(Xi)2∑ni(Yi)槡2其中，X，Y分別代表由標準曲線法和單標定量法計算所得成分含量，n代表樣品個數。可知，5種成分的平均PD均小于5%，兩種方法計算所得濃度具有一定的一致性。所有測定向量得Cos()＞0.9999，表明兩種方法具有較高的相似度。

討論

藥典規定白芷含量測定的質量控制成分為歐前胡素，且該成分在白芷中含量較高，對照品易得，故選擇歐前胡素為內參物。本實驗結果表明，用單標定量法所測得白芷中5種香豆素類成分含量與標準曲線法所測得的含量無明顯差異，說明在缺少對照品的情況下可以通過測定白芷中一種香豆素的含量來計算其他4種同類成分含量，進而更全面地評價藥材質量，實現一測多評。樣品測定結果表明，河北道地白芷藥材中氧化前胡素含量最高，5種主要香豆素類活性成分含量基本符合氧化前胡素﹥歐前胡素﹥異歐前胡素﹥cinidilin﹥佛手柑內酯的順序。熏硫后(樣品7－10)多種香豆素類成分的含量有較大損失，此前也有文獻報道此類現象［2－3］，可見熏硫是白芷樣中香豆素類成分含量下降的主要因素。中藥成分復雜，多成分、多指標的質量控制模式得到越來越多的認可和應用。然而，多指標定量的中藥質量控制模式需要足夠量的具有足夠高純度的對照品，這已成為制約中藥質量控制的一個瓶頸。《中國藥典》2010年版提出一測多評的分析方法［4－5］，該方法實現了中藥多成分定量，解決了中藥化學對照品匱乏的瓶頸問題。然而，一測多評在實際應用于定量測定時，由于只有內參物用到了對照品，其他待測成分無對照品，無法準確地確定待測組分峰(即目標峰)的位置。針對此問題，《中國藥典》2005年版引入了對照提取物，將其作為標準物質收載。對照提取物不但具有相對固定的定的化學組成，含有定量指標的主要效應成分，與原藥材量化關系明確，專屬性強，而且具有安全、穩定的理化特性，尤其適用于中藥的鑒別。對照提取物鑒定和一測多評定量相結合將有助于更加有效地對藥材質量進行控制。

參考文獻:

［1］Ch．P(2010)VolⅡ，中華人民共和國藥典•一部［S］．2015:155．

［2］鄧瑞，張靜，羅維早，等．RRLC－UV同時測定川白芷中6種香豆素類成分的含量［J］．中國中藥雜志，2010，35(23):3184－3187．

［3］ZHENGXG，ZHANGXW，SHENGXN，etal．Simultaneouscharacterizationandquantitationof11coumarinsinRadixAngelicaeDahuricaebyhighperformanceliquidchromatographywithelectros-praytandemmassspectrometry［J］．JPharmBiochemAnal，2010，51(3):599－605．

［4］ZHUJJ，WANGZM，MAXY，etal．AquantitativemethodforsimultaneousdeterminationoffouranthraquinoneswithonemarkerinRheiRadixetRhizoma［J］．ChinHerbMed，2012，4(2):157－163．

［5］王智民，高慧敏，付雪濤，等．“一測多評”法中藥質量評價模式方法學研究［J］．中國中藥雜志，2006，31(23):1925－1928

作者：李德強 段立廣 鄭旭光 戴榮源 張志清 單位：河北醫科大學第二醫院藥學部  河北醫科大學第一醫院 藥劑科 石家莊中國臨床藥理學 雜 志